在這里，我們介紹TwistAmp®液體，一種新的PCR替代形式，使RPA技術更適用于廣泛的研究應用。與PCR擴增相比，RPA只需幾分鐘，而不是幾個小時，可以運行不需要額外設備。TwistAmp®Liquid Basic和Basic試劑盒可用于需要良好保真度，凝膠電泳或固相檢測的應用。TwistAmp®Liquid exo和exo允許快速實時擴增和檢測目標而不犧牲靈敏度或特異性。

概述

      圖1:RPA循環(huán)，重組酶蛋白與引物形成重組絲，并將其插入DNA雙螺旋的互補位點，形成d環(huán)。單鏈dna結合(SSB)蛋白穩(wěn)定雙螺旋結構和d環(huán)的開放。重組酶的分解允許鏈置換聚合酶沿著目標序列延伸引物的3端。當對相反的引物重復這個序列時，指數(shù)擴增發(fā)生而不需要熱變性或退火。

      自2008年推出以來，TwistAmp®試劑盒為科學家提供了一種簡單的方法來進行重組酶聚合酶擴增(RPA)，迄今為止已有250多篇關于該技術的同行評審出版物。RPA是一種等溫替代聚合酶鏈反應(PCR)的方法，它使用三種蛋白質(重組酶，單鏈dna結合蛋白和鏈置換聚合酶)來代替熱循環(huán)(圖1)。RPA在恒定低溫下(理想情況下為37-42°C)效果，反應速度非?？?反應時間小于20分鐘)，可以用穩(wěn)定的凍干顆粒啟動，這使得它非常適合即時測試。此外，RPA用戶已經在各種不同的應用中測試了TwistAmp®試劑盒試劑，包括那些傳統(tǒng)上使用PCR的試劑(如最近對RPA應用的回顧所述1)。與PCR一樣，簡單的RPA使用兩種相反的引物以指數(shù)方式擴增DNA的特定區(qū)域。RPA引物對遵循與PCR引物相似的設計規(guī)則，并且為PCR反應開發(fā)的引物通常在RPA反應中表現(xiàn)良好。

關于TwistAmp®Liquid試劑盒

     為了鼓勵這種多為了鼓勵這種多用途的RPA技術，TwistDx™開發(fā)并推出了TwistAmp®液體試劑盒，為用戶提供更靈活的試劑。TwistAmp®Liquid試劑盒類似于在每個分子生物學實驗室冷凍室中發(fā)現(xiàn)的預制PCR master mixes，包括核心RPA蛋白混合物的甘油儲存管，一管緩沖液，一管驅動重組過程所需的能量混合物和一管用于蛋白質的醋酸鎂輔助因子。

      有四種TwistAmp®液體試劑盒可用:基本和基本RT擴增無探針，適用于凝膠電泳，固相擴增和微陣列應用與尾部引物和適配體;exo和exo RT，它們與基于探針的實時檢測方法兼容。所有四個試劑盒包含相同的核心反應混合物，重組酶，單鏈結合蛋白和鏈置換聚合酶的比例與凍干的TwistAmp®基本試劑盒相同。因此，當使用液體試劑盒時，使用凍干的TwistAmp®基本試劑盒進行的分析當然應該表現(xiàn)得非常相似，但使用其他凍干的TwistAmp®試劑盒進行的分析在使用液體試劑盒時可能會顯示出不同的分析性能。圖2顯示：使用TwistAmp®exo RT和TwistAmp®Liquid exo RT進行的檢測均檢測到50份人呼吸道合胞病毒B RNA模板。除了Core Reaction Mix外，exo試劑盒還包含一管外切酶III，用于處理TwistAmp®外切酶探針進行實時熒光檢測，RT試劑盒包含一管逆轉錄酶，用于將RNA單步轉化為cDNA并隨后擴增。

     TwistAmp®液體試劑盒，類似于他們的凍干對應試劑盒，配制允許擴增片段高達500個堿基對的大小，這足以用于許多常見的PCR實驗室用途(不同的蛋白質制劑正在開發(fā)，以允許更長的擴增子)。這使得RPA成為許多標準實驗室克隆和測序方案中取代PCR的優(yōu)秀候選者。當用于Illumina下一代測序文庫制備時，RPA比校對聚合酶(如Kapa HiFi和Platinum pfx2)導致的錯誤更少。此外，在為合成生物學開發(fā)的端到端自動化微流控平臺上，利用Gibson克隆的等溫變體，RPA已被用于生成更長的754堿基對片段，從而證明了在已建立的聚焦pcr方案中成功實施RPA。

TwistAmp®Liquid試劑盒優(yōu)勢

      與凍干的TwistAmp®試劑盒相比，TwistAmp®Liquid的一個關鍵優(yōu)勢是，科學家可以根據(jù)需要使用盡可能多或盡可能少的TwistAmp®試劑，在他們選擇的容器中進行反應。與PCR不同的是，RPA是等溫的，在相對較低的最佳溫度下工作，并且可以耐受過低溫度和溫度波動。在將主混合物輸送到反應體系之前不需要預熱，并且在較低的等溫溫度下，蒸發(fā)和冷凝的影響不是主要問題。這意味著在小的、分區(qū)的微流體裝置體積中的熱控制得到了簡化:RPA已被證明可以在非常小的(皮升)體積中工作4。RPA的這些屬性也意味著它可以用于比PCR理想的更大體積的反應。圖3顯示：一對PCR引物5成功擴增了淋病奈瑟菌269堿基對片段，反應量為2.5 ~ 5000微升。因此，TwistAmp®液體反應可以在從定制的微流體裝置到標準實驗室96孔板到微離心管，甚至更大的容器中運行。

選擇TwistAmp®液體試劑盒而不是凍干TwistAmp®試劑盒的科學家有更多的選擇性，因為TwistAmp®液體試劑盒不包括脫氧核糖核苷酸三磷酸(dNTPs)。因此，可以用三磷酸脫氧尿苷(dUTP)或標記的核苷酸進行檢測，以允許擴增子捕獲或比色或電化學檢測6 - 8。

總結

RPA已在250多項外部研究中得到應用，并在眾多應用和領域中越來越具有優(yōu)勢。我們的新型TwistAmp®液體是實驗室分子生物學研究中第一個可行的PCR替代品。

1. Lobato, I.M. & O’Sullivan, C.K. Trends Analyt. Chem. 98, 19–35 (2018).

2. Oyola, S.O. et al. BMC Genomics 13, 1 (2012).

3. Linshiz, G. et al. J. Biol. Eng. 10, 3 (2016).

4. Li, Z. et al. PLoS One 11, e0153359 (2016).

5. Sachdev, D., Patel, A.L., Sonkar, S.C., Kumari, I. & Saluja, D. Biomed Res. Int. 2015,

597432 (2015).

6. Koo, K.M., Wee, E.J. & Trau, M. Theranostics 6, 1415–1424 (2016).

7. Wee, E.J., Ngo, T.H. & Trau, M. Clin. Epigenetics 7, 65 (2015).

8. Lau, H.Y. et al. Sci. Rep. 7, 38896 (2017). 

默瑞生物

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