發(fā)布時(shí)間: 2021-12-20 點(diǎn)擊次數(shù): 1346次
隨著PCR技術(shù)的發(fā)展與廣泛應(yīng)用,利用PCR的定量技術(shù)也取得了長(zhǎng)足的發(fā)展。早期主要采用外參照的定量PCR方法,這種方法因影響因素較多,現(xiàn)已逐漸被內(nèi)參照物定量方法和競(jìng)爭(zhēng)PCR定量方法所取代,并在此基礎(chǔ)上發(fā)展了熒光定量
PCR儀方法,使PCR定量技術(shù)提升到新的水平。
分子信標(biāo)技術(shù)也是在同一探針的兩末端分別標(biāo)記熒光分子和猝滅分子。通常,分子信標(biāo)探針長(zhǎng)約25核苷酸,空間上呈莖環(huán)結(jié)構(gòu)。與TaqMan探針不同的是,分子信標(biāo)探針的5'和3'末端自身形成一個(gè)8個(gè)堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu),此時(shí)熒光分子和猝滅分子鄰近,因此不會(huì)產(chǎn)生熒光。當(dāng)溶液中有特異模板時(shí),該探針與模板雜交,從而使探針的發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開,于是溶液便產(chǎn)生熒光。熒光的強(qiáng)度與溶液中模板的量成正比,因此可用于PCR儀的定量分析。該方法的特點(diǎn)是采用非熒光染料作為猝滅分子,因此熒光本底低。
常用的熒光猝滅分子對(duì)是5'-(2'-氨乙基氨基萘-1-磺酸)(EDANS)和4'-(4'-二甲基氨基疊氮苯)苯甲酸(DAB-CYL),采用DAB-CYL作猝滅劑是由于它對(duì)多種熒光素都有很強(qiáng)的猝滅效率。當(dāng)受到336nm紫外光激發(fā)時(shí),EDANS發(fā)出波長(zhǎng)為490nm的亮藍(lán)熒光;DAB-CYL的是非熒光分子,但其吸收光譜與EDANS的發(fā)射熒光光譜重疊。只有分子信標(biāo)時(shí),EDANS和DAB-CYL的距離非常接近,足以發(fā)生FRET,EDANS受激發(fā)產(chǎn)生的熒光轉(zhuǎn)移給DAB-CYL并以熱的形式散發(fā),不能檢測(cè)到熒光;相反,當(dāng)有靶核酸存在時(shí)才可檢測(cè)到熒光。
分子信標(biāo)技術(shù)的不足之處是:
雜交時(shí)探針不能*與模板結(jié)合,因此穩(wěn)定性差;
探針合成時(shí)標(biāo)記較復(fù)雜。分子信標(biāo)技術(shù)結(jié)合不同的熒光標(biāo)記,可用于基因多突變位點(diǎn)的同時(shí)分析。